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[技术篇]免疫组化非特异性背景染色及其控制方法

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幸福的小孩发表于 2006/9/20 17:21:03

免疫组化非特异性背景染色及其控制方法一、非特异性染色的识别常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。二、非特异性染色的原因1. Ig与Fc受体结合多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。避免方法：① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；② 用不含Fc段的抗体，但价格贵（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化） 2．静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。避免方法：① 尽量稀释一抗② 降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；③ 用去垢剂如triton-100处理切片。 Tween-20等； 3.二抗与组织中的Ig结合如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。 4．组织中残存醛基与Ig的结合如醛类固定后未能彻底的冲洗，残流醛基可以和Ig结合。避免方法：①彻底冲洗；② 0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗； 5．内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。避免方法：① 石蜡切片 0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片；② 冰冻切片 3%双氧水处理切片5分钟（99：1）因为未经固定包埋，大部分酶未被破坏；③ 对于骨髓涂片最好用非过氧化物酶标记的抗体如碱性磷酸酶（AP）↓磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料↓快兰(fast blue)或快红(fast red)↓ ↓ 兰色红色用明胶甘油封片，不能用含二甲苯的封片剂，溶于二甲苯。 6. 内源性生物素以 24mg/ml的卵白素封片15分钟；7. 交叉反应PcAb敏感性高，但特异性稍低，容易出现非特异性染色。避免方法：①尽可能稀释抗体；②尽可能用McAb; 三、抗体最大稀释度的求法最大稀释度的目的：1.节约、2.特异性染色↑、非特异性染色↓（决定其最大稀释度）棋盘法如稀释度1：50 1；100 1：150 1；200特异性染色 +++ ++ ++ +非特异性染色 ++ + - - 免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅（二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程 1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。（3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 2）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3、免疫组织化学染色 SP法 1）脱蜡、水化； 2）PBS洗2～3次各5分钟； 3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟； 4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复； 6）PBS洗2～3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗10～15分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。 SABC法1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。12)PBS洗4次每次5分钟。13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。

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